In vitro παραγωγή εμβρύων βοοειδών

Το 1983 η γέννηση των πρώτων μοσχαριών ύστερα από in vitro γονιμοποίηση ήταν γεγονός. Αρχικά, ο κύριος σκοπός της παραγωγής τους ήταν καθαρά ερευνητικός, ως μέσο κατανόησης της in vitro ανάπτυξης του εμβρύου στα βοοειδή, ως κινητήριος μοχλός νέων τεχνολογιών, όπως η πυρηνική μεταφορά (nuclear transfer), και ως μοντέλο από το οποίο θα μπορούσαν να εκμαιευτούν πληροφορίες για άλλα είδη. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι ενώ ο ποντικός αποτελεί το κατεξοχήν ζώο εργαστηρίου για τη μελέτη της in vitro παραγωγής εμβρύων στον άνθρωπο, η ερευνητική ομάδα της D. Berg (2011) μελετώντας την έκφραση πρωτεΐνών βλαστοκύστεων ποντικών, αγελάδων και ανθρώπου, παρουσίασε στοιχεία με βάση τα οποία αποδεικνύεται ακατάλληλο. Συγκριτικοί γονιδιακοί χάρτες έχουν αποδείξει ότι τα γονιδιώματα ανθρώπου και αγελάδας παρουσιάζουν μεγαλύτερη ομοιότητα σε σχέση με εκείνα του ποντικού. Οι ομοιότητες στον τρόπο με τον οποίο είναι οργανωμένο το γονιδίωμα αντανακλώνται ακόμα σε επίπεδο αλληλουχίας νουκλεοτιδίων. Έτσι, η αγελάδα είναι προτιμητέα σα μοντέλο μελέτης της εξωσωματικής γονιμοποίησης του ανθρώπου. Υποστηρίζεται ότι η κληρονόμηση του κεντροσώματος είναι πατρική στον άνθρωπο, ενώ αντίθετα είναι μητρική στα τρωκτικά. Συνεπώς, το μοντέλο της αγελάδας είναι πιο κατάλληλο στη μελέτη διαταραχών που σχετίζονται με τα κεντροσωμάτια των σπερματοζωαρίων. Πάντως, η χρήση ζωικών μοντέλων στην υποβοηθούμενη αναπαραγωγή του ανθρώπου υποσκελίζει πολλές φορές ηθικά, νομικά και τεχνικά προβλήματα που παρουσιάζονται.

Η παραγωγή εμβρύων στο εργαστήριο παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα σε σχέση με τη συμβατική πρόκληση πολλαπλής ωοθυλακιορρηξίας ύστερα από τη χρήση ορμονικών σκευασμάτων. Η IVEP (in vitro embryo production) μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε αγελάδες που η ορμονική παρέμβαση απέτυχε ή ακόμα για την παραγωγή εμβρύων από μία αγελάδα δότρια της οποίας τα ωοκύτταρα θα γονιμοποιηθούν με το σπέρμα διαφορετικών ταύρων και θα προκύψουν διαφορετικοί γενότυποι, επιτυγχάνοντας με αυτόν τον τρόπο γενετική βελτίωση. Ιδιαίτερα μετά τις επιδημίες της Σπογγιόμορφης Εγκεφαλοπάθειας Βοοειδών (Bovine Spongiform Encelopathy-BSE) και του αφθώδους πυρετού (Foot and Mouth Disease-FMD) που ξέσπασαν στην ευρύτερη περιοχή της Ευρώπης, μεγάλος αριθμός ζώων θανατώθηκε για την εκρίζωσή τους. Οι συγκυρίες αυτές, σε συνδυασμό με τις ολοένα και αυξανόμενες ανάγκες του καταναλωτικού κοινού σε τρόφιμα ζωικής προέλευσης, έτσι όπως αυτές αποτυπώνονται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Τροφίμων (Food and Agricultural Organisation-FAO), υποβάλλουν ότι η αύξηση της παραγωγής θα πρέπει να γίνει σε συνδυασμό με την προστασία της γενετικής ποικιλότητας των ζώων και τη διατήρηση της περιβαλλοντικής ακεραιότητας και της ευζωίας τους. Οι τεχνικές υποβοηθούμενης αναπαραγωγής διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στα προγράμματα γενετικής βελτίωσης. Με την εφαρμογή τους, μειώνονται σημαντικά τα μεσοδιαστήματα των γενεών, ενώ προκύπτει μεγάλος αριθμός απογόνων με επιθυμητά παραγωγικά χαρακτηριστικά. Όλα αυτά πάντα σε πλαίσια λογικού κόστους, που να μπορεί να δικαιολογηθεί από την τελική παραγωγή. Τέλος, με την IVEP δίνεται η δυνατότητα διάσωσης του γενετικού υλικού ζώων υπό εξαφάνιση ή ασθενών σε τελικό στάδιο. Οι τεχνικές υποβοηθούμενης αναπαραγωγής αφορούν κυρίως στην in vitro γονιμοποίηση και σε προεκτάσεις αυτής. Στις προεκτάσεις της in vitro γονιμοποίησης συμπεριλαμβάνεται πληθώρα τεχνικών, οι οποίες εφαρμόζονται υπό προϋποθέσεις ανάλογα με την αιτία της υπογονιμότητας. Η in vitro γονιμοποίηση είναι η τεχνική εκείνη κατά την οποία η γονιμοποίηση λαμβάνει χώρα έξω από το σώμα του θηλυκού. Η ανάκτηση των ωοκυττάρων πραγματοποιείται υπό υπερηχοτομογραφική καθοδήγηση με την εισαγωγή λεπτής βελόνης μέσω του κόλπου και αναρρόφηση του ωοθυλακικού υγρού το οποίο περιέχει τα ωάρια. Η τεχνική αυτή περιγράφτηκε για πρώτη φορά το 1987 και ακολουθείται από τη μεταφορά των εμβρύων (embryo transfer), κατά την οποία ένα ή περισσότερα έμβρυα μεταφέρονται στη μήτρα. Το ποσοστό εγκυμοσύνης υπολογίζεται περίπου στο 50%, ύστερα από εξέταση της αγελάδας την 60η ημέρα έπειτα από τη μεταφορά. Στα περισσότερα, όμως, εργαστήρια για καθαρά ερευνητικούς σκοπούς χρησιμοποιούνται και ωοκύτταρα από ωοθήκες αγελάδων από σφαγεία. Οι ωοθήκες μεταφέρονται στο εργαστήριο σε χρονικό διάστημα δύο ωρών και υφίστανται την ανάλογη επεξεργασία. Η IVEP περιλαμβάνει τα ακόλουθα βασικά στάδια : Συλλογή και αξιολόγηση της ποιότητας των ωοκυττάρων. Από τα ωοκύτταρα που θα συλλεχθούν, οδηγούνται για ωρίμανση (maturation) μόνο εκείνα που διαθέτουν ομοιόμορφο και συμπαγές κυτταρόπλασμα και τουλάχιστον 3 στίχους κοκκωδών κυττάρων περιφερικά. Η ωρίμανση λαμβάνει χώρα σε επωαστικό κλίβανο 5% CO2 για 22-24 ώρες στους 37^oC. Αμέσως μετά τη διαδικασία ωρίμανσης τα ωοκύτταρα αξιολογούνται υπό στερεοσκοπική παρατήρηση. Τα κριτήρια της αξιολόγησης στο στάδιο αυτό είναι η εικόνα του κυτταροπλάσματος, η επέκταση των κοκκωδών κυττάρων και η παραγωγή υαλουρονικού οξέος (υγρό μεγάλου ιξώδους). Το κατεψυγμένο σπέρμα που θα χρησιμοποιηθεί στην in vitro γονιμοποίηση (in vitro fertilization, IVF ) προετοιμάζεται κατάλληλα και τοποθετείται μαζί με τα ωοκύτταρα σε ειδική πλάκα με 4 πηγαδάκια. Η επιθυμητή συγκέντρωση είναι 1.000.000 σπερματοζωάρια/ml. Οι γαμέτες παραμένουν μαζί για χρονικό διάστημα που δεν ξεπερνά τις 18-20 ώρες . Ύστερα από το πέρας της in vitro γονιμοποίησης τα ζυγωτά μεταφέρονται σε ειδικό υπόστρωμα καλλιέργειας (SOF-IVC) και παραμένουν ανενόχλητα για 7 ολόκληρες μέρες μέσα σε επωαστικό κλίβανο 5% CO2. Μετά το πέρας 7 ημερών τα έμβρυα αξιολογούνται υπό στερεοσκοπική παρατήρηση (αριθμός και ποιότητα εμβρύων). Ωστόσο, οι νέες αυτές τεχνικές συνοδεύτηκαν από πληθώρα προβλημάτων όπως για παράδειγμα το αυξημένο σωματικό βάρος του εμβρύου (large offspring syndrome), η παρατεταμένη περίοδος κυοφορίας, τα υψηλά ποσοστά αποβολών και περιγεννητικής θνησιμότητας. Γενικά, οι τελικές αποδόσεις σε έμβρυα ικανά για μεταφορά σε αγελάδες-δέκτριες είναι χαμηλές, γεγονός που αυξάνει αρκετά το τελικό κόστος ανά έμβρυο. Νέες έρευνες θα πρέπει να δρομολογηθούν ώστε τελικά να βελτιστοποιηθεί η ποσότητα και ποιότητα των παραγόμενων εμβρύων. Ουσιαστικά, περισσότερη έρευνα απαιτείται πάνω στη μελέτη της τροποποίησης των υποστρωμάτων που χρησιμοποιούνται στην IVEP, των συνθηκών καλλιέργειας και των χειρισμών που υφίστανται οι γαμέτες και τα έμβρυα. Tα τελευταία χρόνια την εμφάνισή της έχει κάνει η χρήση σπέρματος προκαθορισμένου φύλου (sex-sorted semen) και η κατάψυξη ωαρίων και σεξαρισμένων εμβρύων (cryopreservation), που δίνει περαιτέρω δυνατότητες για την εξάπλωση της μεταφοράς εμβρύων. Ειδικά, όσον αφορά την κατάψυξη των ωοκυττάρων, η δημιουργία νέων πρωτοκόλλων κρυοπροστασίας δίνει τη δυνατότητα ανταλλαγής ωοκυττάρων που εξυπηρετεί εμπορικούς σκοπούς, ενώ παράλληλα συμβάλλει σημαντικά στη μείωση του μεσοδιαστήματος των γενεών, καθώς τελευταία και ωοκύτταρα μοσχίδων χρησιμοποιούνται με καλά αποτελέσματα σε προγράμματα γενετικής βελτίωσης. Από τα παραπάνω γίνεται κατανοητό ότι η έρευνα για την ανάπτυξη και εφαρμογή βιοτεχνολογικών μεθόδων στην αναπαραγωγή των βοοειδών αποτελεί έναν κλάδο πολλά υποσχόμενο για το μέλλον. Η σύνδεση της εργαστηριακής έρευνας με την κλινική πράξη θα συνδράμει στην επίλυση προβλημάτων που έχουν ανακύψει και στην καθιέρωση των τεχνικών αυτών σε επίπεδο στάβλου. Η απόκτηση περαιτέρω γνώσεων επάνω στη φυσιολογία και το μεταβολισμό του εμβρύου και τις ανάγκες της καλλιέργειας των εμβρύων αυτού του είδους είναι απαραίτητη για τη βελτιστοποίηση της επάρκειας αυτών των προηγμένων αναπαραγωγικών τεχνικών. Ο ρόλος του κτηνιάτρου στην εφαρμογή αυτών των τεχνικών είναι ουσιαστικός και καίριος σε όλα τα στάδια της τεχνικής.